Bacillus thuringiensis Bt1Fo shtammining tanlangan cry1Ia geni uchun mutagen praymerlarni loyihalash va PCR tahlili

Bacillus thuringiensis bakteriyalari tomonidan ishlab chiqariladigan Cry oilasiga mansub insektitsid oqsillar qishloq xo‘jaligi zararkunandalariga qarshi biologik kurashda muhim ahamiyatga ega. Avvalgi tadqiqotlarda Cry1Ia oqsilining ayrim variantlari shakarqamishning yirik poya zararkunandasi Telchin licusga qarshi faollik ko‘rsatgan. Mazkur ishda Bt1Fo shtammining GenBank bazasida PP897829 kirish raqami bilan saqlangan cry1Ia geni asosida adabiyotlarda tavsiflangan aminokislota almashinuvlariga mos praymerlarni loyihalash va PCR natijalarini dastlabki baholash maqsad qilindi. Tadqiqot doirasida D233N, I116T, L266F va E639G mutatsiyalariga mos praymerlar tanlandi hamda PCR amplifikatsiyasi amalga oshirildi. Gel elektroforezi tasvirida to‘rtta namunaning har birida asosiy DNK tasmalari kuzatildi. Olingan natijalar PCR mahsulotlari mavjudligini dastlabki baholash imkonini berdi.

FUNDAMENTAL VA AMALIY MIKROBIOLOGIYANING BUGUNGI HOLATI VA RIVOJLANISH ISTIQBOLLARI: YOSH OLIMLAR NIGOHI Respublika ilmiy-amaliy anjumani · Toshkent, 2026-yil 30-oktabr

II BIOTEXNOLOGIYA, MOLEKULYAR BIOLOGIYA VA BIOINFORMATIKA DOI 10.66073/ReFocus-Conf/3010039

BACILLUS THURINGIENSIS Bt1Fo SHTAMMINING TANLANGAN cry1Ia GENI UCHUN MUTAGEN PRAYMERLARNI LOYIHALASH VA PCR TAHLILI Reyimberdiyeva Marjon Zafar qizi¹, Karimov Nurbek Rayimovich², Rahimova Sh.Sh.¹, Kobilov Fazliddin Bozorovich³ ¹ Toshkent kimyo-texnologiya instituti ² Mirzo Ulug‘bek nomidagi O‘zbekiston Milliy universiteti ³ O‘zR FA Mikrobiologiya instituti marjonreyimberdiyeva@gmail.com Annotatsiya: Bacillus thuringiensis bakteriyalari tomonidan ishlab chiqariladigan Cry oilasiga mansub insektitsid oqsillar qishloq xo‘jaligi zararkunandalariga qarshi biologik kurashda muhim ahamiyatga ega. Avvalgi tadqiqotlarda Cry1Ia oqsilining ayrim variantlari shakarqamishning yirik poya zararkunandasi Telchin licusga qarshi faollik ko‘rsatgan. Mazkur ishda Bt1Fo shtammining GenBank bazasida PP897829 kirish raqami bilan saqlangan cry1Ia geni asosida adabiyotlarda tavsiflangan aminokislota almashinuvlariga mos praymerlarni loyihalash va PCR natijalarini dastlabki baholash maqsad qilindi. Tadqiqot doirasida D233N, I116T, L266F va E639G mutatsiyalariga mos praymerlar tanlandi hamda PCR amplifikatsiyasi amalga oshirildi. Gel elektroforezi tasvirida to‘rtta namunaning har birida asosiy DNK tasmalari kuzatildi. Olingan natijalar PCR mahsulotlari mavjudligini dastlabki baholash imkonini berdi. Kalit so‘zlar: Bacillus thuringiensis, Cry1Ia, Bt1Fo, praymer dizayni, PCR, mutagenez. Аннотация: Инсектицидные белки семейства Cry, продуцируемые бактерией Bacillus thuringiensis, играют важную роль в биологическом контроле сельскохозяйственных вредителей. В предыдущих исследованиях была продемонстрирована активность отдельных вариантов белка Cry1Ia в отношении крупного стеблевого вредителя сахарного тростника Telchin licus. Целью настоящего исследования являлись разработка праймеров, соответствующих описанным в литературе аминокислотным заменам, на основе гена cry1Ia штамма B. thuringiensis Bt1Fo (номер доступа GenBank: PP897829), а также предварительная оценка результатов ПЦР-амплификации. Были отобраны праймеры, соответствующие заменам D233N, I116T, L266F и E639G, и проведена ПЦР-амплификация. При анализе методом гель-электрофореза во всех четырёх образцах наблюдались выраженные полосы ДНК. Полученные результаты свидетельствуют о предварительном обнаружении продуктов ПЦР. Ключевые слова: Bacillus thuringiensis; Cry1Ia; Bt1Fo; дизайн праймеров; ПЦР; мутагенез Abstract: Insecticidal proteins of the Cry family, produced by Bacillus thuringiensis, play an important role in the biological control of agricultural pests. Previous studies have demonstrated the activity of certain Cry1Ia protein variants against the sugarcane giant borer, Telchin licus. This study aimed to design primers targeting amino acid substitutions previously described in the literature, based on the cry1Ia gene from B. thuringiensis strain Bt1Fo (GenBank accession number: PP897829), and to perform a preliminary assessment of PCR amplification results. Primers corresponding to the D233N, I116T, L266F, and E639G substitutions were selected, and PCR amplification was

IQTIBOS UCHUN Reyimberdiyeva M.Z., Karimov N.R., Rahimova Sh.Sh., Kobilov F.B. Bacillus thuringiensis Bt1Fo shtammining tanlangan cry1Ia geni uchun mutagen praymerlarni loyihalash va PCR tahlili // Fundamental va amaliy mikrobiologiyaning bugungi holati va rivojlanish istiqbollari: yosh olimlar nigohi: Respublika ilmiy-amaliy anjumani materiallari. – Toshkent, 2026. – B. 155–159. DOI: https://doi.org/10.66073/ReFocus-Conf/3010039 performed. Gel electrophoresis revealed prominent DNA bands in all four samples. These findings provide preliminary evidence of PCR product generation.

Keywords: Bacillus thuringiensis; Cry1Ia; Bt1Fo; primer design; PCR; mutagenesis. Kirish Bacillus thuringiensis qishloq xo‘jaligi zararkunandalariga qarshi biologik kurashda keng qo‘llaniladigan, insektitsid xususiyatga ega oqsillar ishlab chiqaruvchi Gram-musbat bakteriyadir [1]. Ushbu bakteriya hosil qiladigan Cry oqsillari sezgir hasharotlarning ichak epiteliysi bilan o‘zaro ta’sirlashib, hujayra membranasi faoliyatini buzishi va hujayralarning nobud bo‘lishiga olib kelishi mumkin [2,3]. Cry oqsillarini kodlovchi genlardan biologik insektitsid preparatlari hamda zararkunandalarga chidamli genetik modifikatsiyalangan ekinlarni yaratishda foydalaniladi [4]. Biroq Cry toksinlarining biologik samaradorligi hasharot turlari orasida farq qiladi. Ularning faolligi oqsilning molekulyar tuzilishi, proteolitik faollashuvi, nishon organizm ichak hujayralari bilan o‘zaro ta’siri va hasharotning fiziologik xususiyatlariga bog‘liq [5]. Shu sababli Cry oqsillarining aminokislota ketma-ketligi va biologik funksiyasi o‘rtasidagi bog‘liqlikni o‘rganish ularning ta’sir mexanizmlarini tushunish va yangi variantlarini tadqiq etish uchun muhim ilmiy yo‘nalish hisoblanadi.

Cry oqsillari oilasida Cry1I guruhi o‘zining molekulyar xususiyatlari va turli hasharot taksonlariga qarshi qayd etilgan biologik faolligi bilan ajralib turadi. Ruiz de Escudero va hammualliflari Cry1Ia 7 oqsilini molekulyar va insektitsid xususiyatlari jihatidan tavsiflab, uning Noctuidae, Tortricidae, Plutellidae oilalari hamda Chrysomelidae oilasining ayrim vakillariga qarshi faolligini ko‘rsatgan [6]. Cry1I oqsillarining nishon organizmlar bilan o‘zaro ta’sirini o‘rganish ularning tabiiy insektitsid xususiyatlarini tavsiflash bilan bir qatorda, oqsil ketma-ketligidagi o‘zgarishlarning biologik faollikka ehtimoliy ta’sirini baholash uchun ham asos yaratadi. Cry1Ia 12 oqsilini ifodalovchi transgen g‘o‘za o‘simliklari bilan bog‘liq tadqiqotlar ham ushbu oqsil guruhining qishloq xo‘jaligi zararkunandalariga qarshi qo‘llash imkoniyatlarini o‘rganish muhimligini ko‘rsatadi [7].

Cry1Ia oqsilining xususiyatlarini o‘zgartirish imkoniyatlarini namoyish etgan muhim tadqiqotlardan biri Craveiro va hammualliflari tomonidan amalga oshirilgan. Mualliflar o‘simliklarda ekspressiya qilishga moslashtirilgan, C-terminal qismi qisqartirilgan sintetik Cry1Ia 12 oqsili — Cry1Ia 12synth variantlarini DNA shuffling va phage display yondashuvlarini birlashtirish orqali o‘rgangan. Olingan variantlar shakarqamishning yirik poya zararkunandasi Telchin licus licusga qarshi tekshirilgan va to‘rtta variantda insektitsid faollik aniqlangan [8]. Tadqiqotda faol variantlar tarkibidagi aminokislota almashinuvlari tahlil qilinib, ularning oqsilning ehtimoliy strukturaviy va funksional xususiyatlari bilan bog‘liqligi muhokama qilingan [8]. Ushbu natijalar Cry1Ia oqsilining ketma-ketligini maqsadli o‘rganish uchun ilmiy asos yaratadi. Biroq muayyan aminokislota almashinuvining funksional ahamiyatini faqat ketma-ketlik yoki strukturaviy taxmin asosida aniqlab bo‘lmaydi; buning uchun molekulyar tahlil va tegishli biologik sinovlar talab etiladi [5].

Kobilov va hammualliflari O‘zbekistonda ajratib olingan Bt1Fo shtammining insektitsid oqsillari bilan bog‘liq genetik xususiyatlarini o‘rganib, tegishli molekulyar ma’lumotlarni taqdim etgan [9]. Mazkur tadqiqotda Bt1Fo shtammining cry1Ia geni uchun GenBank bazasida PP897829 kirish raqami bilan saqlangan nukleotid ketma-ketligi referens sifatida tanlandi. Ushbu ketma-ketlik asosida maqsadli hududlar aniqlandi, praymerlar loyihalashtirildi va keyingi eksperimental tekshiruvlar rejalashtirildi. 1-jadvalda keltirilgan praymerlar Bt1Fo shtammining cry1Ia geni referens nukleotid ketma-ketligi asosida D233N, I116T, L266F va E639G aminokislota almashinuvlariga mos keluvchi hududlarni nishonga olish uchun loyihalashtirildi. Shuningdek, ushbu praymerlar yordamida olingan PCR mahsulotlarini dastlabki baholash va maqsadli hududlarning sekvenslash uchun yaroqliligini aniqlash ko‘zda tutildi.

1-jadval. cry1Ia genining tanlangan hududlarini amplifikatsiya qilish va sekvenslash uchun mo‘ljallangan praymerlar Nishon Havola Praymer Nukleotid ketma-ketligi (5′–3′) hudud I116T I116T-For CAAAAAACTTCAACTTATGCAAGAAATAAAG [10] I116T I116T-Rev GAAGTTTTTGATTAATAATCTCTTCTACATG D233N D233N-For TTATTCCAACCATTTGTGAAAATGGTATAG D233N D233N-Rev ATGGTTGGAATAATCTCCTGCTCGTTCGAC L266F L266F-For GACTTTCATGGTACTAGATTTAGTGG L266F L266F-Rev CATCAAAGTCATGTCTCTACGGAATTG E639G E639G-For GAATTGGCTTTGTTCGGTAGAAG E639G E639G-Rev AAGCCAATTCTATCTATATAAACTTC Materiallar va usullar Referens ketma-ketlik va nishon aminokislota almashinuvlarini tanlash B. thuringiensis Bt1Fo shtammining cry1Ia geni uchun GenBank ma’lumotlar bazasida PP897829 kirish raqami bilan saqlangan nukleotid ketma-ketligi praymerlarni loyihalashda referens ketma-ketlik sifatida tanlandi [9]. Nishon aminokislota almashinuvlari — D233N, I116T, L266F va E639G — Craveiro va hammualliflari tomonidan tavsiflangan Cry1Ia 12synth variantiga oid ma’lumotlar asosida belgilandi [8]. Mazkur aminokislota almashinuvlarining Bt1Fo shtammining Cry1Ia oqsilidagi mosligini baholash uchun tegishli aminokislota ketma-ketliklari SnapGene dasturida o‘zaro taqqoslandi. Taqqoslash natijalari asosida nishon pozitsiyalariga mos keluvchi hududlar aniqlandi va ushbu hududlarni qamrab oluvchi praymerlarni loyihalash uchun nukleotid ketma-ketliklari tanlandi. Loyihalangan praymerlar keyingi PCR amplifikatsiyasi va sekvenslash orqali nishon hududlarini eksperimental tekshirish uchun mo‘ljallandi. Praymerlarni loyihalash To‘rtta nishon aminokislota almashinuviga mos keluvchi nukleotid hududlarini amplifikatsiya qilish uchun praymer juftlari loyihalandi. Keyingi sekvenslash bosqichida foydalanish maqsadida Seq F, Seq R va Seq F mid deb belgilangan qo‘shimcha sekvenslash praymerlari ham tanlandi. Tadqiqotda foydalanilgan barcha praymerlarning nomlari va nukleotid ketma-ketliklari 1-jadvalda keltirilgan. Nukleotid ketma-ketliklari 5′ dan 3′ yo‘nalishda taqdim etildi. Natijalar PCR mahsulotlarini agarozali gel elektroforezi yordamida tahlil qilish PCR amplifikatsiyasi natijasida olingan mahsulotlar agarozali gel elektroforezi yordamida tahlil qilindi. DNK fragmentlarining taxminiy uzunligini aniqlash uchun 1 kb DNK molekulyar markeri ishlatildi. Elektroforez 1% li agarozali gelda o‘tkazildi. DNK fragmentlarini vizualizatsiya qilish uchun etidiy bromid, namunalarning gel bo‘ylab harakatini kuzatish uchun esa bromfenol ko‘ki ishlatildi. Elektroforez natijalari gel tasvirlari asosida baholandi. Hosil bo‘lgan DNK fragmentlarining elektroforetik harakatchanligi va taxminiy uzunligi tahlil qilinib, PCR amplifikatsiyasining dastlabki natijalari baholandi. Ushbu tahlil maqsadli hududlarning amplifikatsiyalanganligini dastlabki baholash imkonini berdi.

1-rasm. cry1Ia genining nishon hududlariga mos PCR mahsulotlarini agarozali gel elektroforezi yordamida tahlil qilish (1% agarozali gel. M — 1 kb DNK molekulyar markeri; 1 — D233N; 2 — I116T; 3 — L266F; 4 — E639G aminokislota almashinuvlariga mos keluvchi nishon hududlaridan olingan PCR mahsulotlari) Bt1Fo shtammining cry1Ia geni uchun tanlangan D233N, I116T, L266F va E639G nishon hududlarini amplifikatsiya qilish maqsadida PCR reaksiyalari amalga oshirildi. Agarozali gel elektroforezi natijasida to‘rtta namunaning har birida yaqqol DNK fragmentlari kuzatildi (1-rasm). Ushbu natijalar barcha to‘rtta PCR reaksiyasida amplifikatsiya mahsulotlari hosil bo‘lganini dastlabki baholash imkonini berdi. Muhokama Mazkur tadqiqot Bt1Fo shtammining cry1Ia geni referens ketma-ketligi asosida Cry1Ia oqsilidagi tanlangan aminokislota almashinuvlariga mos hududlarni amplifikatsiya qilish uchun praymerlarni loyihalash va PCR tahlilining dastlabki bosqichini tavsiflaydi. Tadqiqotning dolzarbligi Cry oqsillarining tuzilishi va biologik xususiyatlarini maqsadli o‘zgartirish imkoniyatlarini o‘rganish bilan bog‘liq. Avvalgi tadqiqotlar insektitsid oqsillarga kiritilgan aminokislota almashinuvlari ularning funksional xususiyatlariga ta’sir qilishi mumkinligini ko‘rsatgan. Biroq bunday ta’sirning yo‘nalishi va darajasi oqsil turi, kiritilgan o‘zgarishlarning xususiyati hamda tekshirilayotgan hasharot turiga bog‘liq. Ushbu ishda Bt1Fo shtammining cry1Ia geni uchun GenBank ma’lumotlar bazasida PP897829 kirish raqami bilan saqlangan nukleotid ketma-ketligi referens sifatida tanlandi. Nishon aminokislota almashinuvlari — D233N, I116T, L266F va E639G — Craveiro va hammualliflari tomonidan tavsiflangan Cry1Ia 12synth variantiga oid ma’lumotlar asosida belgilandi. Tegishli hududlarni amplifikatsiya qilish uchun praymerlar loyihalandi va PCR mahsulotlari agarozali gel elektroforezi yordamida dastlabki baholandi. To‘rtta namunada ham DNK fragmentlarining kuzatilishi tanlangan hududlarni keyingi molekulyar tahlil qilish uchun dastlabki asos yaratdi. Cry1Ia oqsilining faollashuvi, proteolitik qayta ishlanishi, oligomerlanishi va turli hasharotlarga nisbatan biologik faolligi bilan bog‘liq mexanizmlarni o‘rganish Cry oqsillarining funksional xususiyatlarini tushunishda muhim ahamiyatga ega. Shu nuqtayi nazardan, tanlangan aminokislota almashinuvlariga mos hududlarni molekulyar tahlil qilish keyingi tadqiqotlar uchun dastlabki bosqich hisoblanadi. Biroq hozirgi natijalar faqat PCR mahsulotlari hosil bo‘lganini ko‘rsatadi; ular nishon ketma-ketliklarning to‘g‘riligini yoki aminokislota almashinuvlarining mavjudligini o‘z-o‘zidan tasdiqlamaydi. Keyingi bosqichda PCR mahsulotlarini sekvenslash va olingan ketma-ketliklarni referens cry1Ia geni bilan taqqoslash rejalashtiriladi. Bu nishon hududlarning identifikatsiyasini tekshirish va tegishli nukleotid o‘zgarishlarini aniqlash imkonini beradi. Shundan so‘nggina ushbu o‘zgarishlarning Cry1Ia oqsilining xususiyatlariga ehtimoliy ta’siri haqida asoslangan xulosalar chiqarish mumkin.