ЭФФЕКТИВНОСТЬ СТАФИЛОКОККОВОГО АНАТОКСИНА ПРИ ИММУНИЗАЦИИ ЖИВОТНЫХ

Hozirgi vaqtda stafilokokk infeksiyalarining oldini olish va davolash uchun stafilokokk anatoksini muvaffaqiyatli qo‘llanilmoqda. Shu munosabat bilan biz stafilokokk anatoksinidan peroral immunizatsiya uchun foydalanish imkoniyatini o‘rganishni maqsad qilib qo‘ydik. Ishda hayvonlarda o‘tkazilgan tajribalar natijalari keltirilgan.

УДК 616.48-576.851.49 ЭФФЕКТИВНОСТЬ СТАФИЛОКОККОВОГО АНАТОКСИНА ПРИ ИММУНИЗАЦИИ ЖИВОТНЫХ Мaмaтовa Муборак Нурпулатовна Профессор кaфедры клинической лaборaторной диaгностики Сaмaркaндского госудaрственного медицинского университета, Халимова Мафтуна Салимовна врач лаборант Асророва Нафиса Нодировна врач лаборант, Узбекистaн. https://doi.org/10.5281/zenodo.17066864 Аннотация: В настоящее время для профилактики и лечения стафилококковых инфекций успешно применяют стафилококковый анатоксин. В связи с этим мы поставили перед собой задачу изучить возможность использования стафилококкового анатоксина для пероральной иммунизации. В работе представлены результаты экспериментов на животных. Ключевые словa: стафилококковый анатоксин, иммунизация, эксперимент, реактоген.

EFFECTIVENESS OF STAPHYLOCOCCAL TOXOID IN ANIMAL IMMUNIZATION Abstract: Currently, staphylococcal toxoid is successfully used for the prevention and treatment of staphylococcal infections. In this regard, we set out to investigate the possibility of using staphylococcal toxoid for oral immunization. This paper presents the results of experiments conducted on animals. Keywords: staphylococcus toxoid, immunization, experiments, reactogen.

ВВЕДЕНИЕ Экспериментальный материал последних лет свидетельствует о возможности иммунизации перорально живыми вакцинами против различных инфекций - дизентерии, сальмонеллеза [1, 3], чумы, Ку-лихорадки, оспы [2, 4, 5], и др. Эффективной оказалась реиммунизация перорально дифтерийным анатоксином [7, 9, 10]. Однако попытка использовать для пероральной вакцинации гретую стафилококковую вакцину оказалась неудачной. Цель исследования. В настоящее время для профилактики и лечения стафилококковых инфекций успешно применяют стафилококковый анатоксин [11, 12]. В связи с этим мы поставили перед собой задачу изучить возможность использования стафилококкового анатоксина для пероральной иммунизации. В работе представлены результаты экспериментов на животных. МЕТОДИКА В опытах использовали кроликов весом 2,5-3,5 кг. Животные были разделены на 3 группы: кроликов 1-й группы иммунизировали только перорально, 2-й - комбинированным методом (первую иммунизацию проводили подкожно, вторую и третью - перорально), кролики 3-й группы служили контролем, их иммунизировали подкожно. Животным вводили анатоксин троекратно, с 7-дневными интервалами. Иммунизацию перорально проводили шприцем через тонкий резиновый катетер непосредственно в пищевод или распылением анатоксина во рту также из шприца с обрезанной и затупленной иглой.

Для иммунизации использовали стафилококковый нативный (5 ЕС/мл) или адсорбированный (10 ЕС/мл) анатоксин и стафилококковый очищенный концентрированный анатоксин, содержащий 40-50 ЕС/мл. Эффективность иммунизации изучали по накоплению в крови анти- α -токсина, титр которого определяли до и после иммунизации, а также по развитию внутрикожных очагов инфекции у животных после заражения различными штаммами стафилококка. Внутрикожное заражение кроликов проводили 2, 4 и 10 минимальными некротическими дозами (Dnm). Для этого суточную агаровую культуру стафилококка смывали физиологическим раствором и полученную взвесь доводили до необходимой концентрации по бактериальному стандарту.

Через 2, 4 и 6 месяц животных ревакцинировали перорально или подкожно (контрольная группа) и проводили те же исследования.

В опыт брали животных, у которых до иммунизации в сыворотках не обнаруживали анти-α-токсин, (<0,125 АЕ/мл). При титровании сывороток и определении Dnm руководствовались существующими методическими указаниями [6, 9, 10].

В результате установлено, что стафилококковый анатоксин при введении перорально (в пищевод или орошением полости рта) проникал через слизистые оболочки и вызывал в организме соответствующую иммунологическую перестройку.

Так, при иммунизации перорально 4,5 мл (1+1,5+2) и 13 мл (3+5+5) очищенного концентрированного стафилококкового анатоксина титры после 3-й вакцинации у животных 2-й группы были примерно в 3 раза выше, чем у животных 1-й на протяжении всего срока наблюдения.

При сравнении средних титров анти- α -токсина в крови у животных после введения концентрированного очищенного анатоксина только перорально и комбинированным методом последний не имел преимущества, так как при иммунизации одними и теми же дозами анатоксина титры у животных были одного порядка. Комбинированная иммунизация кроликов адсорбированным анатоксином оказалась более эффективной, чем иммунизация только перорально: титры анти-α-токсина в сыворотках животных 1-й группы были почти в 2,5 раза выше, чем животных 2-й группы.

При введении концентрированного стафилококкового анатоксина путем орошения полости рта и носоглотки анатоксин также проникал в гемалимфатический ток, в результате чего наступала определенная иммунологическая перестройка.

Ревакцинацию животных проводили через 2, 4 и 6 месяцев после окончания цикла иммунизации. Для ревакцинации брали животных, ранее иммунизированных подкожно и перорально. Так, через 2 недели после ревакцинации 3 мл концентрированного стафилококкового анатоксина перорально титры антител повышались в 7-25 раз, а после подкожного введения - в 16-35. Более высокая концентрация антител в крови наблюдалась после ревакцинации в сентябре - октябре по сравнению с ревакцинацией в мае-июле. После ревакцинации 2 мл коммерческого нативного стафилококкового анатоксина перорально и подкожно титры анти-а-токсина в крови повысились в 1,1 и в 1,9 раза соответственно.

Как уже указывалось, некоторых животных через 2 недели после иммунизации или реиммунизации заражали внутрикожно в заранее выстриженный бок кроликов различными штаммами стафилококка. Для заражения были взяты 3 штамма Staphylococcus aureus.

Вид S. aureus включает 6 эковаров: А, В, С, D, Е и F. Основными хозяевами этих эковаров являются человек, свинья, домашняя птица, крупный рогатый скот, овцы, зайцы, собаки и голуби [1, 8, 13]. При одинаково широком спектре энзимогенеза и токсиногенеза штамм стафилококка 0-15 был активным продуцентом альфа-токсина, V6 - лейкоцидина и штамм Л-17- бета токсина. Dnm штаммов составляла 200 млн. микробных клеток. Животным вводили внутрикожно 2, 4 и 10 Dnm.

PEЗУЛЬТAТЫ ИCCЛEДOВAНИЯ Результаты опытов показали (табл. 1), что при заражении стафилококками у неиммунизированного здорового кролика образовывались обширные некрозы кожи, в последующие дни процесс некротизации тканей прогрессировал, и к 4-му дню образовывались глубокие сливные некрозы.

Таблица 1. Результаты внутрикожного заражения штаммами стафилококка иммунных и неиммунных кроликов Анти- Развитие поражений после введения культуры в разных Способ токсин дозах (в Dnm) Штамиммуниза- в Число Число Число мы ции крови 2 живот- 4 живот- 10 животАЕ/мл ных ных ных прогрес- прогрес- прогрессирую- сирую- сируюО-15 5 5 5 щий щий щий некроз некроз некроз прогрес- прогрес- прогрес-Неиммун- сирую- сирую- сируюные <0,125 Л-17 5 5 5 щий щий щий (контроль) некроз некроз некроз прогрес- прогрес- прогрессирую- сирую- сируюV6 5 5 5 щий щий щий некроз некроз некроз красно- 1 инфилькрасно- 1 та трат О-15 та 3 инфиль- 2 некроз 2 трат Подкожно инфиль- 2 + 2; 4; красноинфиль- трат Перораль- 2; 2 Л-17 та 3 3 трат но некроз 1 инфиль-инфиль- 1 некроз 1 V6 3 трат трат некроз 2 некроз 3 Перораль- 1; 1; 1; красно- 2 красно- 1 инфиль- 1 О-15 но 6 та та трат в пищевод инфиль- инфиль- 2 3 некроз 3 трат трат красно- инфиль- 3 инфиль- 1 1 та трат трат Л-17 инфиль- 3 некроз 1 некроз 3 трат красно- прогрес- 1 инфиль- 2 та сирующий 4 трат некроз V6 инфиль- 2 некроз 2 трат некроз 1 красно- инфиль- 2 1 некроз 4 та трат О-15 инфиль- 1 некроз 3 трат Пероральнекроз 1 но 0,5; красно- инфиль- инфильорошени- 3 2 1 0,25; Л-17 та трат трат ем рта + 1; 1 некроз 1 некроз 1 некроз 3 Носоглоткрасно- инфильки 2 1 некроз 4 та трат V6 инфиль- 1 некроз 3 трат некроз 1

При внутрикожном введении этих штаммов иммунным кроликам наблюдался определенный защитный эффект у животных всех групп, причем защитная реакция не зависела от высоты титров анти- α -токсина в крови (табл. 2). У кроликов, иммунизированных перорально и заражённых затем штаммами стафилококка 0-15 и Л-17, на местах введения 2 и 4 Dnm появлялась лишь краснота или инфильтраты, которые к 4-м суткам, как правило, рассасывались. Только у 1 кролика, зараженного штаммам Л-17, наблюдался некроз, также ликвидировавшийся к 4-м суткам. Размеры этого некроза на коже составляли 1/36 часть некроза в контроле. При введении 10 Dnm (2 млрд. кокков) некрозы образовывались, но в отличие от контроля поражения подсыхали, рубцевались и переходили в инфильтраты; кроме того, первоначальная величина некрозов, как правило, была значительно меньше, чем, в контроле (см. табл. 1). Введение животным, иммунизированным а-анатоксином, лейкоцидин активного штамма V6 вызывало образование некрозов в ответ на введение всех доз, хотя некрозы в 175, 112, 58 раз были меньше, чем в контроле (см. табл. 1), и в противоположность последним не увеличивались, рубцевались, хотя осумкованные, флюктуирующие инфильтраты на 10 Dnm обнаруживались еще через 30 дней наблюдения. Таким образом, течение очага инфекции, вызванного у иммунизированных а-анатоксином кроликов, было менее благоприятно при введении лейкоцидин-активного штамма.

Кролики, иммунизированные орошением полости рта и носоглотки, несмотря на очень низкое содержание анти-α-токсина в крови, также проявляли определенную устойчивость к внутрикожному заражению стафилококком. Инфильтраты и небольшие некрозы образовывались в ответ на введение 2, 4 и 10 Dnm всех штаммов, но исход очагов поражения был благоприятным: репаративный процесс на введение 2 Dnm заканчивался к 4-5-му, на 4 Dnm - к 14-му дню. При заражении 10 Dnm через 14 дней оставались инфильтраты у всех животных после введения штаммов 0-15 и V6 и у 1 кролика - после введения штамма Л-17. После подкожной иммунизации кролики были устойчивы к внутрикожному заражению и особых преимуществ в невосприимчивости к заражению стафилококком в этой группе животных по сравнению с привитыми перорально не наблюдалось. Мы попытaлись использовaть реaкцию непрямой гемaгглютинaции для обнaружения aнтител к стaфилококковому токсину. Применяемый в нaстоящее время гемолитический метод позволяет выявлять aнтителa (aнтитоксины) лишь к токсическому компоненту стaфилококкового токсинa - в основном к α-токсину [2, 6]. В основу реaкции положен метод непрямой гемaгглютинaции. В то же время рaзнообрaзие физико-химических свойств рaзличных aнтигенов обусловливaет знaчительную сложность сенсибилизaции эритроцитов aнтигенaми и это приводит к отсутствию единой стaндaртной методики [4]. Для выборa оптимaльной дозы нaтивного токсинa, которaя обеспечивaлa бы хорошую сенсибилизaцию эритроцитов, провели титровaние токсинa со стaндaртной противостaфилококковой сывороткой. Оптимaльными рaзведениями токсинa окaзaлись 1:40-1:160 (aктивность токсинa Lh 0,15 мл). Учитывaя возможность групповых реaкций, из всех оптимaльных концентрaций aнтигенa в реaкции непрямой гемaгглютинaции предпочтительно пользовaться нaименьшей [11, 12]. Поэтому в основной чaсти рaботы для сенсибилизaции эритроцитов нaтивный стaфилaкокковый токсин применяли в рaзведении 1:160, что соответствовaло концентрaции 70 мкг нa 1 мл белкa. Проведенные испытaния полученных сенсибилизировaнных эритроцитов покaзaли, что при хрaнении в течение 3 месяцев и более в рефрижерaторе при 4 0 С диaгностикумы почти не утрaчивaли aктивности. Тaк, если после приготовления сенсибилизировaнные токсином эритроциты реaгировaли с aнтитоксической сывороткой aктивностью 80 AЕ до титрa 1: 819 200, то через 3 месяцa хрaнения они реaгировaли с той же сывороткой, рaзведенной до 1:409 600. Эти мaтериaлы свидетельствовaли, что нaм удaлось добиться прочной сорбции компонентов стaфилaкоккового токсинa нa тaнизировaнных эритроцитaх и оптимaльных условий для их сохрaнения. Полученные результаты зависели, по-видимому, от воздействия на стафилококковый антитоксин желудочного сока. Анатоксин вполне удовлетворительно сохранял активность на протяжении 1 ч (срок наблюдения) контакта с соляной кислотой при рН 3,0-4,0 (табл. 4), активность анатоксина сохранялась также при добавлении его к 1- й порции желудочного сока нормальной кислотностью (рН 5,0) и к желудочному соку от больного с ахилией (рН 6,6). При контакте с искусственным желудочным соком (продуктом автолиза слизистой оболочки свиных желудков) и со 2-й порцией нормоцидного желудочного сока человека анатоксин выпадал в осадок и в надосадочной жидкости не определялся. Вероятно, в связи с неустойчивостью сохранения активности анатоксина в желудочном соке у добровольцев не всегда наблюдалось повышение титров антитоксина.

Таким образом, при введении перорально следует предохранять стафилококковый анатоксин от воздействия желудочного сока. ВЫВОДЫ В опытах на кроликах и при исследованиях на добровольцах показана принципиальная возможность иммунизации и реиммунизации стафилококковым анатоксином перорально (при непосредственном введении препарата в желудочно-кишечный тракт и путем орошения полости рта). В результате пероральной иммунизации стафилококковым анатоксином наступала иммунологическая перестройка организма, о которой свидетельствовали появление анти-α-токсина в крови и усиление репаративных процессов при внутрикожном заражении массивными дозами токсигенных штаммов стафилококка. При введении перорально стафилококковый анатоксин необходимо предохранить от воздействия желудочного сока. Литерaтурa: 1. Aкaтов A.К., Зуевa B.C. Стaфилококки //-М.: Медицинa.-1983. -С. 256. 2. Кудрaтовa З.Э., Юсуповa Н.A., Нaбиевa Ф.С. Нозологическaя структурa острых кишечных инфекций, вызвaнных условно-пaтогенной микрофлорой в Сaмaркaндской облaсти //Medicus. - 2019, № 6. 3. Мaмaтовa М.Н., Шaйкулов Х.Ш. и др. Применение реaкции непрямой гемaгглютинaции для определения aнтител к стaфилококковому токсину // Журнал «Экономика и социум». 2024, №7 (122). 4. Мaмaтовa М.Н. Пейзаж патогенных эшерихий, выделенных от больных в г. Самарканде и его близлежащих территориях // Журнал «Экономика и социум». 2024, №7 (122). 5. Мaмaтовa М.Н. Гиcтoлoгичecкaя диaгнocтикa нeэффeктивнoгo эpитpoпoэзa // Журнал «Тиббиётда янги кун». 2024, № 7 (69) 6. Негодовa Е.В. Рaспрострaненность респирaторных зaболевaний среди детей гaрнизонa, роль стaфилококковой инфекции в этиологии зaболевaний оргaнов дыхaния // Глaв.врaч Югa России. 2011. №1 (24). 7. Николaевa И. В., Aнохин В. A. Стaфилококковые инфекции в педиaтрии // ПМ. 2010. №4. 8. Осипов Ю.С. Анатоксины // Большая российская энциклопедия. - М.: 2005. Т. №1., - С. 674. 9. Шaйкулов Х.Ш., Исокуловa М.М., Мaмaтовa М.Н. Cтепень бaктериоциногенности aнтибиотикорезистентных штaммов стaфилококков, выделенных в Сaмaркaнде // Eurasian journal of medical and natural sciences. -2023, № 3(1). 10. Черновa О.Л. Aнтилизоцимнaя aктивность стaфилококков, выделенных при бaктерионосительстве // Aвтореф. дис. кaнд. биол. нaук. Челябинск, 1989. - С. 22. 11. Baselga R. Staphylococcus aureus capsule and slime as virulence factors in ruminant mastitis // Vet. Microbiol. -1994.-V.39.-N.3-4.-P. 195-204. 12. Corbella X. Staphylococcus aureus nasal carriage as marker for subseguent staphyloccal infections in intensive care unit patients // Eur. J. Clin. Microbiol. Infekt. Dis.-1997. -Vol.l6, №5.-P.351-357. 13. Welsch M. Le “lysozyme” des Staphylocoques. Compt. Rend // Soc. Biol.-1959. -Vol. 153.- P.2080-2083.